近日，真邁生物與合作單位上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一人民醫(yī)院在Frontiers in Genetics的Genomic Assay Technology版塊上發(fā)表了題為“Systematic comparison of variant calling pipelines of target genome sequencing cross multiple next-generation sequencers”的研究成果。該研究涵蓋了兩種腫瘤panel：TSO500和TargetSeq One；三種典型樣本：FFPE，cf DNA（cell-free DNA）?和cell line；六個(gè)主流的NGS測(cè)序平臺(tái)：NovaSeq 6000，NextSeq 550，MGISEQ 2000，GenoLab M，F(xiàn)ASTASeq 300，SURFSeq 5000；五種常用的突變分析軟件：HaplotypeCaller，Mutect2，SiNVICT，SNVer和VarScan 2。

靶向基因組測(cè)序(TS)是一種有效的高通量測(cè)序(NGS)方法，重點(diǎn)關(guān)注與疾病發(fā)病機(jī)制或臨床相關(guān)的一組基因或靶點(diǎn)。它通過(guò)快速檢測(cè)基因變異，為臨床醫(yī)生提供參考，幫助他們解釋病人基因圖譜，并為實(shí)施個(gè)性化的抗癌提供建議，極大地促進(jìn)了腫瘤精準(zhǔn)化的發(fā)展。

TSO500是一個(gè)全面的靶標(biāo)測(cè)序panel，涵蓋超過(guò)8種癌癥類型和523種癌癥相關(guān)基因(1.94 Mb)，用于捕獲FFPE標(biāo)準(zhǔn)品HD832，而TargetSeq One kit 用于富集Twist cf DNA。本研究中，6個(gè)乳腺癌和卵巢癌的cell line的panel數(shù)據(jù)來(lái)自于公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)SRA。

TSO500靶向測(cè)序平臺(tái)與軟件間的比較

如圖1a和1b所示，NovaSeq 6000，NextSeq 550，GenoLab M和FASTASeq 300四個(gè)測(cè)序平臺(tái)在SNP和InDel檢測(cè)的靈敏度（sensitivity）方面表現(xiàn)出幾乎一致的結(jié)果，雖然SiNVICT和Mutect2在InDel的calling上有一些細(xì)微差異。FASTASeq 300測(cè)序儀基于SNVer和VarScan2軟件，可以檢出樣本中全部的SNP和InDel突變（sensitivity=100%）。對(duì)于F-score和精確度（precision），SNVer和VarScan2在SNP和InDel檢測(cè)上也表現(xiàn)最好。此外，與ddPCR驗(yàn)證的真集相比，四個(gè)測(cè)序平臺(tái)一致性都比較高，特別是使用SNVer和VarScan2兩個(gè)分析工具(1c）。

Pearson相關(guān)系數(shù)(r)熱圖(圖1d)顯示，在相同的軟件下，不同測(cè)序平臺(tái)呈現(xiàn)出相似的整體性能。隨后，研究者比較了不同測(cè)序平臺(tái)與分析軟件間高置信度變異的檢測(cè)數(shù)量(圖1e)，發(fā)現(xiàn)所有數(shù)據(jù)集的一致性高達(dá)93.4%(198/212)。其中，F(xiàn)ASTASeq 300能檢測(cè)到更多的特有突變，特別是通過(guò)SNVer和VarScan2兩個(gè)軟件。

綜上，在SNP和InDel的突變檢出方面，分析軟件間比測(cè)序平臺(tái)間表現(xiàn)出的差異更大，F(xiàn)ASTASeq 300在SNVer和VarScan2軟件下表現(xiàn)更優(yōu)。

一般而言，測(cè)序深度的增加有助于變異檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)和低頻突變的檢出，但需要更長(zhǎng)的分析時(shí)間、更高的計(jì)算復(fù)雜度以及成本。研究者以突變檢出表現(xiàn)最好的FASTASeq 300測(cè)序平臺(tái)和SNVer以及VarScan2兩款軟件為研究重點(diǎn)，比較了不同測(cè)序深度下變異檢測(cè)時(shí)間、內(nèi)存使用、SNP和InDel檢測(cè)靈敏度的差異，期望探索到保證高靈敏度的情況下所需的最低測(cè)序深度(圖1f和1g，結(jié)果表明：至少500x的測(cè)序深度可以保證全部突變的檢出，而VarScan2軟件消耗內(nèi)存更少，運(yùn)行時(shí)間更短）。

TargetSeq One捕獲的cf DNA測(cè)序平臺(tái)與分析軟件的比較

對(duì)于cf DNA樣本，軟件SNVer和VarScan2在SNP和InDel檢測(cè)方面表現(xiàn)出色。F-score, 召回率（recall）和精確度都接近100% (Fig. S2)，三個(gè)測(cè)序平臺(tái)NovaSeq 6000，MGISEQ 2000和SURFSeq 5000結(jié)果也很一致。

cell line樣本的分析軟件比較

通過(guò)下載公開(kāi)數(shù)據(jù)集，研究者獲取到3個(gè)乳腺癌和3個(gè)卵巢癌的panel測(cè)序結(jié)果，并使用上述五款軟件進(jìn)行突變檢測(cè)，結(jié)果表明：SNVer和VarScan2兩款軟件同樣表現(xiàn)更優(yōu)，其檢測(cè)結(jié)果最接近真集。

不同測(cè)序平臺(tái)在同一個(gè)分析軟件下，突變檢測(cè)的一致性較好。三種類型的腫瘤樣本，在突變檢測(cè)方面，SNVer和VarScan2均表現(xiàn)最優(yōu)。該項(xiàng)研究為腫瘤靶向測(cè)序提供了一個(gè)benchmark。該研究使用五種軟件對(duì)三種典型的腫瘤樣本進(jìn)行變異檢測(cè)的性能評(píng)估，也為未來(lái)腫瘤變異研究提供了有價(jià)值的參考。

Feng B, Lai J, Fan X, et al. Systematic comparison of variant calling pipelines of target genome sequencing cross multiple next-generation sequencers[J]. Frontiers in Genetics, 2023, 14: 1293974.