近日，真邁生物在Genomics, Proteomics & Bioinformatics（IF11.5,Genetics?&?Heredity JCR Q1）上發(fā)表了題為“A Two-color Single-molecule Sequencing Platform and Its Clinical Applications”的研究成果。該研究介紹了真邁生物GenoCare 1600系列單分子基因測(cè)序平臺(tái)的雙色熒光測(cè)序化學(xué)原理，并完成了大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)序，下機(jī)數(shù)據(jù)一致序列的準(zhǔn)確率達(dá)到99.99%。研究者還評(píng)估了GenoCare 1600在微生物混合物和新冠患者咽拭子樣本上的檢測(cè)性能。研究結(jié)果表明：GenoCare 1600可以完成微生物的定量，靈敏地識(shí)別新冠狀病毒，并能準(zhǔn)確檢測(cè)病毒的突變位點(diǎn)（通過(guò)Sanger測(cè)序驗(yàn)證），以上性能顯示了其優(yōu)秀的臨床應(yīng)用潛力。
過(guò)去二十年，DNA測(cè)序技術(shù)已成為科研和診斷領(lǐng)域的關(guān)鍵工具。人類基因組計(jì)劃的完成，高通量測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing, NGS）取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，尤其是基于邊合成邊測(cè)序（sequencing-by-synthesis）的技術(shù)。與此同時(shí)，單分子測(cè)序技術(shù)（Single-molecule sequencing）也取得顯著突破，如：Pacific Biosciences采用零模波導(dǎo)檢測(cè)單個(gè)DNA聚合酶延伸發(fā)出熒光信號(hào)的single-molecule real-time、Oxford Nanopore Technologies的納米孔測(cè)序技術(shù)。雖然這兩種測(cè)序技術(shù)產(chǎn)生的reads更長(zhǎng)（>10 Kb），但因測(cè)序通量低（單個(gè)run下機(jī)reads數(shù)少）、試劑成本高以及實(shí)驗(yàn)繁瑣等因素大大限制其在臨床上的應(yīng)用。
01??單分子雙色測(cè)序化學(xué)實(shí)驗(yàn)流程與性能
經(jīng)過(guò)72 cycles，雙色反應(yīng)系統(tǒng)的read長(zhǎng)度就達(dá)到約41 nt，比單色反應(yīng)系統(tǒng)120 cycles的read長(zhǎng)了2 nt，均能產(chǎn)出10 M reads，而且整體錯(cuò)誤率比單色更低。實(shí)驗(yàn)操作方面，文庫(kù)構(gòu)建步驟少，時(shí)間短，DNA文庫(kù)1.5 h (圖1A)，RNA文庫(kù)2.8 h (圖1B)。
圖1 單分子測(cè)序的文庫(kù)制備通用流程
簡(jiǎn)單基因組（phi X174 噬菌體）測(cè)序，24 h獲得了334.3 M reads，平均每條lane的數(shù)據(jù)量為20.9 M unique reads，變異系數(shù)為4.5%。模式物種大腸桿菌，全基因測(cè)序需要15 h，豐度最高的reads為70 nt，平均測(cè)序讀長(zhǎng)53 nt（圖2A）。平均每條lane的數(shù)據(jù)量為12.2 M，僅有0.61%的mismatch，1.45%的插入錯(cuò)誤，2.76%的缺失錯(cuò)誤。整體測(cè)序深度為130×（圖2B），基因組覆蓋率為99.94%，一致序列準(zhǔn)確度為99.99%。為了模擬臨床樣本的病原微生物檢測(cè)，研究者混合了大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、M13噬菌體、釀酒酵母以及人源DNA，并將GenoCare 1600的測(cè)序結(jié)果與高通量測(cè)序平臺(tái)Hiseq 4000與qPCR得到的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示：GenoCare 1600檢測(cè)M13噬菌體含量在10－6到10－3時(shí)與理論濃度一致，優(yōu)于qPCR。
圖2 大腸桿菌基因組樣本的單分子測(cè)序結(jié)果
03??精準(zhǔn)檢測(cè)新冠病毒突變位點(diǎn)
既然，GenoCare?1600在檢測(cè)單一噬菌體、細(xì)菌以及混合的微生物樣本方面都表現(xiàn)出優(yōu)異性能，那么，該平臺(tái)能用于新冠病毒的溯源研究嗎？研究人員采集了3例新冠陽(yáng)性患者和一名健康志愿者的咽拭子。對(duì)于陽(yáng)性樣本，GenoCare 1600測(cè)序得到的超過(guò)5萬(wàn)條reads可以比對(duì)到新冠病毒的基因組，覆蓋了整個(gè)基因組99.9%的區(qū)域。此外，檢測(cè)得到的突變位點(diǎn)，均經(jīng)過(guò)Sanger測(cè)序方法進(jìn)行了驗(yàn)證，其中位于ORF8（location 28144）的T-C突變被確認(rèn)為當(dāng)時(shí)流行的新冠病毒株特有突變位點(diǎn)。
1.?雙色測(cè)序化學(xué)提升了單分子測(cè)序的效率，相對(duì)于單色，cycle數(shù)更少，read更長(zhǎng)；
2.?GenoCare 1600測(cè)序平臺(tái)可以快速并準(zhǔn)確檢測(cè)病原細(xì)菌和RNA病毒；
3.?GenoCare 1600測(cè)序平臺(tái)可以準(zhǔn)確檢測(cè)新冠病毒的突變位點(diǎn)；
4.?單分子測(cè)序平臺(tái)操作簡(jiǎn)便，對(duì)于缺少NGS測(cè)序經(jīng)驗(yàn)的臨床機(jī)構(gòu)更為友好。
Chen F, Liu B, Chen M, et al. A Two-color Single-molecule Sequencing Platform and Its Clinical Applications[J]. Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 2024: qzae006.