丨全基因組進化樹及遺傳多樣性分析
通過對26個樣本進行三代+二代測序，該研究成功組裝了32條完整的HAdVs基因組序列，被歸類為HAdV-B、C和E三類。進化分析揭示了HAdV-B類包含B3、B7和B55三個基因型，而HAdV-C類則包含C1、C2和C5三個基因型。值得注意的是，S9樣本中存在兩條35 Kb左右的長contig，且被劃分為不同的系統(tǒng)發(fā)育分支，表明它們的進化軌跡存在差異，并且提示S9樣本可能存在混合共感染的情況。在遺傳多樣性方面，該研究發(fā)現(xiàn)HAdV-C在六鄰體基因（hexon）、纖維基因（fiber）和E3基因區(qū)域中展現(xiàn)出顯著的高多樣性。在基因組的其他區(qū)域，HAdV-C的遺傳多樣性低于HAdV-B。
圖1 HAdVs全基因組進化樹及多樣性分析
丨S9樣本混合感染的驗證
通過計算機模擬限制性內(nèi)切酶分析，該研究發(fā)現(xiàn)S9樣本的兩條contig與已知的HAdV-C5和HAdV-C2參考基因組存在明顯的遺傳相似性。隨后的序列比對分析顯示，全基因組同源性分別高達98.68%和99.69%，并且在關(guān)鍵病毒核衣殼基因（Hexon,?Penton, Fiber）序列中存在很高的相似性。以上結(jié)果證實了S9樣本中腺病毒混合感染的復(fù)雜性，還展示了混合組裝的優(yōu)勢，對于病毒菌株的精確基因分型和揭示病毒感染的復(fù)雜性至關(guān)重要。
圖2 S9樣本混合感染研究
丨腺病毒基因的一致性及多樣性分析
HAdV-B、C和E中，Hexon、Fiber、E3基因的進化樹分析結(jié)果與全基因組高度一致，而在Penton、E1A、E1B、DNA pol和E4基因區(qū)域，HAdV-C顯示出較低的遺傳多樣性，未形成清晰的分支。核苷酸一致性分析進一步確認了HAdV-C在E1A、E1B、DNA pol、Penton和E4基因區(qū)域的高度遺傳保守性，而Hexon、Fiber和E3基因區(qū)域則表現(xiàn)出較低的核苷酸同源性和較高的多樣性。同義/非同義突變分析顯示，HAdV-B和HAdV-C的大部分基因Ka/Ks比小于1，表明它們主要處于純化選擇下。然而，HAdV-C E4基因的Ka/Ks比值大于1，暗示存在正選擇作用，增強病毒對宿主的適應(yīng)性。這種增強可能是通過調(diào)節(jié)宿主細胞功能、促進病毒DNA復(fù)制及RNA加工過程來實現(xiàn)的。
圖3 HAdVs基因多樣性、一致性及突變情況分析
丨重組分析
重組是HAdV進化的主要驅(qū)動力之一，可能影響病毒的宿主適應(yīng)性和傳播能力。在本次組裝得到的基因組中，HAdV-C的重組網(wǎng)絡(luò)比HAdV-B更為復(fù)雜，并且識別出了更多的重組事件。重組斷點遍布整個基因組，特別是在HAdV-C中，Hexon和Fiber基因區(qū)域存在兩個明顯的重組熱點。此外，S9樣本的重組分析顯示，S9-contig1可能是一個涉及C5參考菌株和S9-contig2的重組序列。
圖4 HAdVs重組分析
丨共線性和GC含量分析
共線性分析揭示了HAdV-B和HAdV-C同種內(nèi)菌株序列的高度相似性，這一發(fā)現(xiàn)為理解腺病毒的遺傳穩(wěn)定性提供了重要線索。GC分析表明，基因組中容易發(fā)生同源重組的區(qū)域，GC含量明顯較低，特別是在Hexon、E3、Fiber和E4基因區(qū)域。這些區(qū)域不僅核苷酸多樣性高，而且還是重組的熱點區(qū)域。
圖5 HAdVs共線性及GC含量分析